近日，由中信湘雅生殖與遺傳?？漆t院（以下簡稱“中信湘雅”）林戈課題組和深圳市真邁生物科技有限公司（以下簡稱“真邁生物”）聯合組成的研究團隊在預印本服務網站BioRxiv在線發表了題為Accurate CNV identification from only a few cells with low GC bias in a single-molecule sequencing platform的學術論文。
論文結果展示，團隊合作研發的基于GenoCare單分子測序儀的微量細胞檢測方案在檢測靈敏度和時間上優于傳統NGS（Next generation sequencing）檢測方法，這是我國自主開發的單分子測序平臺首次應用于單細胞及微量細胞研究領域的案例，研究成果將進一步推動國產基因測序平臺在未來臨床研究和應用中的廣泛普及。
在基于微量細胞進行拷貝數異常（CNV，Copy number variation）分析的科研及臨床診斷的多種應用中，NGS（Next generation sequencing）相比于傳統的FISH（Fluorescence in situ hybridization）、aCGH（Array comparative genomic hybridization）芯片檢測等技術具有更高的檢測分辨率和更大的發展潛力。盡管已有的NGS技術在這一領域的應用已較為成熟，但仍有改進和提升的空間。
首先，由于獲取的樣本細胞數極少，受限于二代測序平臺對建庫起始量的要求，必須在建庫前對樣本進行全基因組擴增（Whole Genome Amplification, WGA）。盡管WGA技術在不斷發展，其擴增過程中引入的偏差仍會或多或少地影響檢測結果的可靠性和靈敏度；其次，現有檢測方法建庫流程較為復雜，導致整體檢測周期較長，一般來說從樣本制備到獲得最終的檢測結果至少需要2天的時間?，F有技術的普及還受到成本較高的限制。
基于這些亟待解決的問題，中信湘雅聯合真邁生物共同研發出了一套基于單分子測序技術的微量細胞CNV檢測體系，在保持檢測結果準確度的同時提升染色體異常檢測的靈敏度，大大降低檢測過程的復雜度以及檢測成本。該研究團隊開發了一種基于細胞直接裂解結合Tn5轉座酶系統的建庫方法，可以跳過傳統意義上的WGA步驟直接進行建庫，采用該方法可對低至5個細胞進行直接裂解建庫，并成功在單分子基因測序儀GenoCare 1600上完成了測序和數據分析。研究結果表明，相比于基于WGA的建庫方法，該建庫方法具有明顯更低的GC偏好（圖1）。
圖1 基于不同建庫方法的GC 偏好對比
為了驗證該體系的染色體異常檢測能力，該研究對6種帶有不同染色體微小結構變異的細胞系進行了檢測（其中最小的染色體結構異常為1.29M的一段染色體缺失），并將單分子測序系統的分析結果與二代測序平臺Illumina HiSeq X Ten的結果進行了一致性分析。研究結果表明，該檢測體系的分析結果與基于二代測序平臺的分析結果完全一致，對低至1.29M的染色體結構異?？蓽蚀_檢出（圖2）。
圖2? 基于GenoCare 1600與HiSeq X Ten的CNV測序結果對比（染色體異常：46, XX, del(1p36.33-1p36.32) 1.29M）
在基于微量細胞為研究樣品的不同應用場景中，嵌合一直是困擾科研人員的一個重要因素。如在植入前胚胎中，染色體非整倍體嵌合情況較為常見。而不同類型和比例的嵌合對臨床結局有一定影響。因此，對于少量細胞的染色體非整倍體嵌合狀況進行準確檢測顯得尤為重要。根據國際植入前遺傳學診斷學會PGDIS（Preimplantation Genetic Diagnosis International Society）的建議，高于80%的異常嵌合建議按非整倍體處理，低于20%的異常嵌合建議按整倍體處理，介于20~80%之間的異常嵌合可作為臨床醫生的參考，根據具體情況來選擇處理方案。該研究團隊同時對該檢測體系的嵌合異常胚胎的檢出效力進行了評估，將正常細胞系gDNA與染色體異常細胞系gDNA按0%~100%的不同比例進行混合模擬不同的嵌合比率進行建庫測序檢測分析。結果表明，該檢測體系可對低至20%的異常嵌合成功檢出（圖3）。
圖3 基于GenoCare 1600的微量細胞系CNVs檢測結果
（染色體異常：46, XY, dup(2p25.3-2p16.2) 53.26M，20%嵌合）
?論文第一作者、中信湘雅胡亮博士表示，中信湘雅一直致力于與國內同道共同推進植入前遺傳領域新技術的研發、應用和推廣。與現有檢測方法比較，本次基于Tn5轉座酶系統建庫并利用GenoCare單分子測序平臺進行CNV檢測，在保持高準確度的同時，盡量減少了WGA引起的GC偏好性。另外，該策略的檢測流程也比較簡單。
論文共同通訊作者、真邁生物醫學研發總監張萌表示，作為一種新的平臺方案，基于單分子測序的微量細胞檢測在靈敏度、時間和成本上都具有明顯的優勢。期待這種新的方法能為科研工作者的研究提供一種新的思路，我們也會通過不斷的測試和完善去推動它早日作為一種篩查診斷方案應用至臨床，造福更多的普通人。
據悉，中信湘雅與真邁生物將進一步完善實驗設計，適時開展相關基礎及臨床研究，以充分驗證和推動單分子基因測序技術的廣泛應用。
關于中信湘雅
中信湘雅生殖與遺傳?？漆t院（原中南大學湘雅醫學院不孕與遺傳?？漆t院）是現代化大型生殖與遺傳?？漆t院，前身是中南大學湘雅醫學院人類生殖工程研究室門診部。
自1980年在我國醫學遺傳學奠基人盧惠霖教授的指導下，盧光琇教授在國內開展人類輔助生殖技術研究和臨床工作以來，先后于1988年被衛生部批準為國家精子庫技術指導中心，2007年成為衛生部公布的人類輔助生殖技術和人類精子庫技術培訓基地，2017年成為國家基因檢測技術應用示范中心（湖南孕前診斷分中心）。
醫院歷經30余年的探索和實踐，現已經發展成為經衛生部審查批準，擁有湖南地區合格人類冷凍精子庫的三級生殖與遺傳?？漆t院。2017年獲全國衛生計生系統先進集體榮譽稱號，同年獲湖南省創新獎。
關于真邁?
真邁生物（GeneMind Biosciences）創立于2012年，總部現設于深圳羅湖，擁有辦公、研發和生產場地共8000余平米。真邁生物專注于基因測序產業上游設備和試劑的研發制造，以自主開發的第三代單分子基因測序儀為核心，具備從原料、試劑到設備、軟件的全流程解決方案，是國際上屈指可數的擁有自主基因測序儀品牌的硬科技企業。
真邁全職團隊共100余人，其中經政府認定的“高層次人才”占25%以上，海內外研究生學歷50%以上。公司擁有180余項國內外專利授權和申請（包括中國、美國、歐洲等地區），17項計算機軟件著作權，覆蓋基因測序平臺的“儀器-試劑-芯片-算法-應用”全流程模塊。
真邁生物擁有自主開發的國產單分子基因測序儀GenoCare及配套試劑盒，可無需擴增直接檢測DNA信息。目前，GenoCare已通過醫療器械注冊檢驗，單分子測序通用試劑盒已獲得第一類醫療器械備案資質。同時，GenoCare單分子基因測序儀等5項產品已獲得歐盟CE標志，是首個獲得歐盟CE標志的國產第三代基因測序儀產品。